Ausgabe 1 (2003)

Nach der EU Richtlinie 86/609/EWG (EU 1986) zum Umgang mit Versuchstieren, die auch die gesetzliche Grundlage für das Deutsche Tierschutzgesetz bildet, darf nach § 7.2 "ein Tierversuch nicht durchgeführt werden, wenn eine wissenschaftlich fundierte tierversuchsfreie Methode zur Verfügung steht, die in der Praxis experimentell erprobt ist." Weiterhin heißt es in Artikel 23 derselben EU Richtlinie: "Die EU Kommission und die Mitgliedsstaaten sollen Forschung zur Entwicklung und Validierung von Alternativmethoden fördern, die die gleichen Informationen wie der Tierversuch liefern aber geringere Tierzahlen erfordern oder weniger belastend sind, und sie sollen die Rahmenbedingungen für diese Forschung stärken." Diese gesetzlichen Vorgaben wurden von verschiedenen EU Mitgliedsstaaten unterschiedlich umgesetzt. Beispielsweise hat Deutschland bereits 1989 im damaligen Bundesgesundheitsamt BGA die Zentralstelle zur Erfassung und Bewertung von Ersatz- und Ergänzungsmethoden zum Tierversuch ZEBET gegründet, während die meisten EU Mitgliedsstaaten - mit wenigen Ausnahmen - keine eigenen Förderprogramme für Alternativmethoden zu Tierversuchen initiiert haben und sich auf Aktivitäten der EU Kommission verlassen.

In Abbildung 1 sind die europäischen Zentren zur Förderung von Alternativmethoden dargestellt. Aus der Abbildung wird deutlich, dass danach in England in Nottingham die Stiftung FRAME (Fund for the Replacement of Animals in Medicial Experiments) und in den Niederlanden das NCA (National Centre for Alternatives) im Reichsgesundheitsamt (RIVM) gegründet wurden und von der EU Kommission im Jahr 1992 das EU Valdierungszentrum ECVAM (European Centre for the Validation of Alternative Methods) in der Gemeinsamen Forschungsstelle (GFS) in Ispra/Italien. Wegen der Erfolge der europäischen Zentren wurde außerhalb Europas im Jahr 1995 von der Regierung der USA das Validierungszentrum ICCVAM (Interagency Coordinating Committee for the Validation of Alternative Methods) im Rahmen des National Toxicology Program NTP gegründet, und Polen hat 2001 als zukünftiges Beitrittsland der EU das Zentrum für Alternativmethoden "Vitryna" in Lodsz etabliert.

Abbildung 1 Zentren für die Entwicklung und Validierung von Alternativmethoden zu Tierversuchen in Europa. Seit 1995 besteht in den USA das Validierungszentrum der Bundesbehörden ICCVAM und seit 2001 in Polen das Zentrum für Alternativmethoden Vitryna. Vergrößerte Version

7. Änderung der EU Kosmetikrichtlinie
im Jahr 2003 verabschiedet

1. Bereits 2003 müssen folgende tierversuchsfreien Methoden angewendet werden:

Bei der Prüfung aller Fertigprodukte und bei Prüfung von Inhaltsstoffen auf Penetration durch die Haut, auf ätzende und auf phototoxische Eigenschaften.

2.  Bis Ende 2006 soll auf folgende Tierversuche verzichtet werden:

Die Prüfungen auf augenreizende, hautreizende und hautsensibilisierende Eigenschaften.

3. Bis Ende 2012, also in 10 Jahren, soll auf folgende Tierversuche verzichtet werden:

Die Prüfung auf embryotoxische Eigenschaften.

4.  Auch im Jahre 2013 werden folgende komplexen Tierversuche nach Einschätzung  der EU Kommission für die Prüfung von Kosmetika noch erforderlich sein:

Die Prüfungen auf fruchtbarkeitshemmende und auf krebserzeugende Eigenschaften sowie die Bestimmung der Verteilung und des Metabolismus von Fremdstoffen im Organismus (Toxikokinetik).

Grundsätzlich müssen unabhängig von dieser Terminsetzung in der 7. Änderungsrichtlinie der EU Kosmetikverordnung alle sicherheitstoxikologischen Alternativmethoden anstelle von Tierversuchen angewendet werden, wenn sie nach experimenteller Validierung von der EU als offizielle Prüfmethoden für chemische Stoffe in den Anhang V der EU Gefahrstoffverordnung (EU Richtlinie 67/548/EEC, EU 1967) aufgenommen wurden.

Sicherheitstoxikologische Prüfungen sind für alle chemischen Stoffe vorgeschrieben und zwar, aus Arbeitsschutzgründen, um Arbeiter zu schützen, die bei der Herstellung mit ihnen in Berührung kommen. Weitere Prüfungen sind zum Verbraucherschutz unter Berücksichtigung der Anwendung vorgeschrieben, z.B. für Kosmetika, Nahrungsmittelzusatzstoffe und Arzneimittel. Außerdem müssen seit wenigen Jahren Prüfungen zur Umweltverträglichkeit neuer Stoffe durchgeführt werden. International hat es sich in der Toxikologie als zweckmäßig erwiesen, in einem ersten Schritt die gefährlichen Eigenschaften eines Stoffes in international standardisierten Tierversuchen zu bestimmen, z.B. in Europa nach den Vorschriften der EU (EU Gefahrstoffverordnung, EU Richtlinie 67/548/EEC) und weltweit nach den Prüfmethoden der OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development) (OECD 1982). Die in der EU vorgeschriebenen toxikologischen Prüfmethoden werden im Anhang V der Gefahrstoffverordnung publiziert. Sie sind zusammengefaßt in Tabelle 1 wiedergegeben, dabei sind die Methoden besonders hervorgehoben, mit denen die lokale Verträglichkeit der Inhaltsstoffe von Kosmetika geprüft wird.

Tabelle 1:
Sicherheitstoxikologische Prüfmethoden der EU und OECD
	akute Versuche mit einmaliger Applikation
•	akute Toxizität, dermal & oral
•	Augenreizung/-ätzung
•	Hautreizung/-ätzung
•	Sensibilisierung der Haut
•	Hautpenetration
II.	Langzeitversuche mit mehrfacher Applikation
	subakute Toxizität
	subchronische Toxizität
	>chronische Toxizität
III.	spezielle und organspezifische Toxikologie
	Metabolismus & Toxikokinetik (ADME)
	Neurotoxizität & Immunotoxizität
	Teratogenität/Embryotoxizität
	Reproduktionstoxikologie
•	Genotoxizität/Mutagenität
	Karzinogenität
	• = Diese Prüfmethoden sind für die Verträglichkeitsprüfung von Inhaltsstoffen von Kosmetika unerläßlich

Wenn die In Tabelle 1 aufgeführten sicherheitstoxikologischen Tierversuche entsprechend der 7. Änderung der EU Kosmetikrichtlinie 76/768/EEC durch tierversuchsfreie Methoden ersetzt werden sollen, müssen die neuen Methoden entsprechend den Empfehlungen der EU und der OECD (OECD 1996) experimentell validiert werden, um nachzuweisen, dass die Ergebnisse, die mit den neuen Methoden erzielt werden, in gleicher Weise eine Abschätzung der gefährlichen Eigenschaften neuer Substanzen gestatten, wie die etablierten Tierversuche. Das prinzipielle Vorgehen bei der experimentellen Validierung toxikologischer Prüfmethoden in mehreren Laboratorien unter blinden Bedingungen mit einer ausreichen großen Zahl von Prüfsubstanzen ist in Abbildung 2 schematisch wiedergegeben (OECD 1996). Es ist offensichtlich, dass es relativ lange dauert und sehr teuer ist, bis eine neue Methode erfolgreich die langen Weg der Validierung durchlaufen hat und auch international von allen OECD Mitgliedsstaaten anerkannt wird, d.h. von allen wichtigen Industrienationen. Bisher wurden von EU und OECD nach etwa 10-jähriger experimenteller Validierung nur 4 tierversuchsfreie Alternativmethoden in die offiziellen behördlichen Prüfrichtlinien aufgenommen, und zwar Teste zur Prüfung auf ätzende und phototoxische Eigenschaften sowie auf Penetration durch die Haut und auf sensibilisierende bzw. allergisierende Wirkung an der Haut.

Abbildung 2 Experimentelle Validierung toxikologischer Prüfmethoden: Es werden die wesentlichen Elemente des 1996 von der OECD harmonisierten Verfahrens zur Entwicklung und experimentellen Validierung toxikologischer Methoden dargestellt, die in gleicher Weise für Tierversuche und für tierversuchsfreie Alternativmethoden gelten(OECD 1996). Vergrößerte Version

Die bisherigen Fortschritte bei der Entwicklung, Validierung und behördlichen Anerkennung tierversuchsfreier sicherheitstoxikologischer Prüfmethoden werden nachfolgend erläutert:

1. Augenreizung

Die einfache Forderung, den stark belastenden Draize-Test am Kaninchenauge zur Prüfung auf augenreizende Eigenschaften mit Hilfe einer oder mehrerer in vitro Methoden zu ersetzen, hat sich trotz aufwendiger Validierungsstudien nicht erfüllt. Ursache dafür ist, dass

1.   der Draize-Tests für unterschiedlichen Zwecken eingesetzt wird, und zwar zur Prüfung von Stoffen auf

- Unbedenklichkeit bei Anwendung am Auge sowie
- auf geringe und
- auf stark augenreizende Eigenschaften

2. zum anderen werden im Draize-Test Reaktionen an verschiedenen Teilen des Organs Auge (Bindehaut, Hornhaut und Linse)  bewertet und

3. außerdem werden bei internationaler Betrachtung die Reaktionen im Draize-Test von  nationalen Behörden mit sehr unterschiedlichen Maßstäben bewertet.

Ein grundsätzliches, bekanntes Problem ist beim Draize-Test am Kaninchenauge außerdem die schlechte Reproduzierbarkeit, die bereits 1971 in den USA von Weil und Scala in einer umfangreichen Validierungsstudie nachgewiesen wurde und deren Ergebnis in Abbildung 3 dargestellt ist.

Abbildung 3 Validierung des Draize Tests am Kaninchenauge in toxikologischen Laboratorien in den USA (Weil und Scala, 1971). Es wurden die 3 Stoffe, die mit unterschiedlichen Farben dargestellt sind, in 24 Laboratorien (A-X) im Draize Test geprüft und dabei stark variierende Klassifizierungen von nicht reizend bis stark reizend für denselben Soff erzielt. Vergrößerte Version

In Europa wurde eine große Zahl von Alternativmethoden zum Ersatz des Draize-Test entwickelt und validiert. Bisher ist die Anwendung der neuen Methoden nur zur Einstufung und Kennzeichnung von Stoffen mit stark augenreizenden Eigenschaften gestattet. In Abbildung 4 sind die vier Alternativmethoden zusammengestellt, die in unterschiedlichen EU Mitgliedsstaaten entwickelt und validiert wurden. Prüfergebnisse, die mit den vier in vitro Tests erzielt werden, werden von allen EU Mitgliedsstaaten anerkannt werden. Nicht so positiv ist die Situation außerhalb Europas, obwohl die OECD seit 1987 die Entwicklung von Alternativmethoden zum Draize-Test am Kaninchenauge mit Nachdruck von ihren Mitgliedsstaaten fordert. Tierversuchsfreie in vitro Tests zur Unterscheidung zwischen nicht und gering augenreizenden Eigenschaften, wie sie für die Kosmetikindustrie wichtig sind, werden bisher trotz intensiver experimenteller Validierung für behördliche Zwecke noch nicht akzeptiert. Das berücksichtigt die 7. Änderung der EU Kosmetikrichtlinie.

Abbildung 4 Alternativmethoden zur Prüfung von Stoffen mit stark augenreizenden Eigenschaften, die in der EU für behördliche Prüfungen anerkannt sind. Es handelt sich um den HET-CAM Test am bebrüteten Hühnerei, den BCOP (bovine cornea opacity and permeability) Test, den IRE (isolated rabbit eye) Test an Kaninchenaugen und den ICE (isolated chicken eye) Test am Hühnerauge , dabei stammen die Augen jeweils aus Schlachthofmaterial. Vergrößerte Version

2. Reizwirkung an der Haut

Die Ergebnisse im Draize Test an der Kaninchenhaut zur Prüfung auf hautreizende Eigenschaften sind nach Meinung der EU Experten der DG Gesundheit und Verbraucherschutz nur teilweise auf den Menschen übertragbar. ECVAM und die OECD favorisieren eine neue Prüfstrategie, in der in vitro Methoden, die sich in toxikologischen Laboratorien der Industrie bewährt haben, mit einer anschließender Verträglichkeitsprüfung an freiwilligen Probanden am Menschen kombiniert werden. Mehrere EU und OECD Mitgliedsstaaten, wie z.B. Deutschland und Österreich, lehnen aus ethischen Gründen die Prüfung am Menschen anstelle der Prüfung im Tierversuch grundsätzlich ab. Eine ECVAM Validierungsstudie mit künstlicher menschlicher Haut (Modell EpiDerm^TM), die 1999-2000 durchgeführt wurde, ergab aufgrund der nicht ausreichenden Reproduzierbarkeit der biologischen Schädigungsparameter leider nicht das erwünschte erfolgreiche Ergebnis. Im Jahr 2003 hat ECVAM zusammen mit dem US Validierungszentrum ICCVAM eine internationale Validierungsstudie mit kommerziellen menschlichen Hautmodellen begonnen. Vom Ergebnis dieser Studie, an der alle wichtigen Hersteller von Kosmetika beteiligt sind,  wird es abhängen, ob Ende 2006 auf Tierversuche zur Prüfung auf hautreizende Eigenschaften verzichtet werden kann, ohne den Verbraucherschutz zu gefährden, wie es in der 7. Änderung der EU Kosmetikrichtlinie vorgesehen ist.

3. Ätzwirkung an Haut und Schleimhäuten

ECVAM hat 1998 erfolgreich eine Validierungsstudie mit drei in vitro Methoden zur Prüfung auf Ätzwirkung an der Haut abgeschlossen, und zwar mit Rattenhaut und künstlicher menschlicher Haut (Episkin^TM & EpiDerm^TM), dabei handelt es sich um biotechnologisch hergestellte, kommerzielle vertriebene menschliche Hautmodelle. Im Jahr 2000 wurden diese validierten Methoden von der EU Kommission als offizielle Prüfmethoden in den Anhang V der Gefahrstoffverordnung (EU Richtlinie 67/548/EEC) aufgenommen (EU Kommission, 2000a). Sie müssen deshalb nach EU Richtlinie 86/609/EWG zum Schutz von Versuchstieren angewendet werden und in den EU Mitgliedsstaaten sind Tierversuche zu diesem Zweck verboten. Besonders erfreulich ist, dass im Jahr 2002 die Expertenkommission der OECD eine spezielle Methode zur Prüfung auf Ätzwirkung mit menschlichen Hautmodellen für die weltweite Anwendung akzeptiert hat (OECD 2002a). Die erfolgreiche Entwicklung und Validierung dieser in vitro Methode mit dem Hautmodell EpiDerm^™ wurde vom deutschen Validierungszentrum ZEBET koordiniert.

4. Sensibilisierung an der Haut

Sensibilisierende bzw. allergisierende Wirkungen sind die häufigste unerwünschte Eigenschaft chemischer Stoffe (10%). Bei Stoffen, die in Kosmetika eingesetzt werden sollen, sind sensibilisierende Eigenschaften nicht akzeptabel. Deshalb ist die Prüfung auf sensibilisierende Eigenschaften bei der sicherheitstoxikologischen Prüfung von Kosmetika unerläßlich. Der bisher übliche Sensibilisierungstest an der Haut von Meerschweinchen nach Magnusson und Kligman ist stark belastend weil Adjuvantien zur Reaktionsverstärkung in die Haut gespritzt werden und weil die immunologische Reaktion an der geschädigten Haut des Meerschweinchens geprüft wird. Seit 2001 akzeptieren die EU Mitgliedsstaaten, die USA und alle OECD Mitgliedsstaaten den sehr viel weniger belastenden LLNA (local lymphnode assay), der an den Ohr-Lymphknoten von Mäusen durch geführt wird, deren Wachstumshemmung in der in vitro Kultur geprüft wird (OECD 2002b). Der LLNA ist zwar kein reiner in vitro Test sondern ein „ex vivo Test“, bei dem die Belastung für die Versuchstiere stark reduziert ist.

5. Penetration durch die Haut

Bei Stoffen, die in Kosmetika oder als Pflanzenschutzmittel eingesetzt werden sollen, ist für die sicherheitstoxikologische Bewertung die Aufnahme durch die Haut entscheidend für die Wirkung im gesamten Körper. Die EU Expertenkommission für Kosmetika, das SCCNFP, hat grundsätzlich entschieden, daß Inhaltsstoffe von Kosmetika toxikologisch nicht auf systemische Wirkungen geprüft werden müssen, wenn sie nicht durch die Haut aufgenommen werden. Deshalb hat die Prüfung auf Hautpenetration eine entscheidende Bedeutung bei der Verträglichkeitsprüfung von Kosmetika. Im Juni 2001 hat die OECD die Prüfung auf Hautpenetration mit menschlicher Haut, die aus Operations-Material stammt, als einen der ersten weltweit gültigen in vitro Toxizitätstest zur Anerkennung empfohlen (OECD 2002c).

5. Phototoxizität

Seit 1992 hat ZEBET eine EU/COLIPA Prävalidierungs- und Validierungsstudie von in vitro Phototoxizitätstests koordiniert, die 1998 mit der experimentellen Validierung des 3T3 NRU in vitro Phototoxizitätstests (3T3 NRU PT Test) erfolgreich abgeschlossen wurde, bei dem eine Fibroblastenzellinie der Maus eingesetzt wird. Abbildung 5 veranschaulicht ein typisches Beispiel für einen phototoxischen Stoff im 3T3 NRU in vitro Phototoxizitätstest. Die Ergebnisse der Validierungsstudie mit 30 Prüfsubstanzen unter blinden Bedingungen in 10 Laboratorien in Europa und den USA sowie eine zusätzlich Validierungsstudie mit 10 UV-Filterstoffen, die in Sonnenschutzmitteln eingesetzt werden, bestätigten, dass die Ergebnisse im 3T3 Test eine bessere Prädiktion der phototoxischen Eigenschaften für den Menschen ermöglichen als sie mit jeder anderen in vivo oder in vitro Prüfmethode erzielt wird (Spielmann et al., 1998 a,b). Im Jahr 2000 hat deshalb die EU Kommission den 3T3 NRU PT Test als einzigen Phototoxizitätstest in den Anhang V der Gefahrstoffverordnung aufgenommen (EU Kommission, 2001c), so daß nur noch dieser in vitro Test für behördliche Zwecke in Europa eingesetzt werden darf und daß außerdem Tierversuch für diesen Zweck verboten sind. Im Jahr 2002 hat darüber hinaus eine Expertenkommission der OECD den 3T3 NRU PT als offizielle weltweite Prüfmethode zur Phototoxizitätsprüfung akzeptiert (OECD, 2002d). Damit ist der 3T3 NRU PT Test der erste in vitro Toxizitätstest, der nach erfolgreicher experimenteller Validierung weltweit für behördliche Zwecke akzeptiert wird.

Abbildung 5 Beispiel für einen phototoxischen Stoff (Ketoprofen), der im 3T3 NRU PT in vitro Phototoxizitätstest zu einem positiven Ergebnis führt. Der Test wird in einer Mikrotiterplatte mit 96 Reaktionsgefäßen durchgeführt. UV-Bestrahlung führt bei der phototoxischen Substanz in der unteren Platte zu einer phototoxischen Reaktion, die dosisabhängig zur Entfärbung führt. Vergrößerte Version

Tierschutz und die Entwicklung
neuer Kosmetika sind miteinander vereinbar

Der wissenschaftliche Beirat des EU Validierungszentrums ECVAM hat im Jahr 2001 im Zusammenhang mit dem Vorschlag der EU Kommission für eine neue Chemikalienpolitik abgeschätzt, dass für toxikologischen Prüfmethoden in ca. fünf Jahren validierte, tierversuchsfreie Alternativmethoden zur Verfügung stehen werden. Die in Abbildung 6 zusammengefaßte Bewertung macht deutlich, dass für die wichtigsten Gebiete der Toxikologie sehr bald tierversuchsfreie Methoden zur Verfügung stehen werden (EU Kommission 2001).

Literatur

EU Kommission (1976) EU Richtlinie 76/768/EEC zur Angleichung der gesetzlichen Grundlagen für kosmetische Produkte in den Mitgliedsstaaten. Brüssel, Belgien: EU DG Umwelt.

EU Kommission (1986) EU Richtlinie 86/609/EEC zu Schutz von Versuchstieren. Brüssel, Belgien: EU DG Umwelt.

EU Kommission (1983) EU Richtlinie 83/467EEC zur fünften technischen Anpassung der EU Richtlinie 67/548/EEC an die Gesetzgebung für die Klassifizierung, Verpackung und Kennzeichnung von Gefahrstoffen. Brüssel, Belgien: EU DG Umwelt.

EU Kommission (2000a) EU Richtlinie 2000/33/EU für die 21^st Änderung von Anhang V der EU Richtinie 67/548/EEC zur Klassifizierung, Verpackung und Kennzeichnung von Gefahrstoffen: Test Methode B-40 "Hautätzung - in vitro Methode”. O. J. der EU Kommission vom 8. Juni 2000, L136, 85-97.

EU Kommission (2000b) EU Richtlinie 2000/33/EU für die 21^st Änderung von Anhang V der EU Richtinie 67/548/EEC zur Klassifizierung, Verpackung und Kennzeichnung von Gefahrstoffen: Test Methode B-41 "Phototoxizität – in vitro 3T3 NRU Phototoxizitätstest ”. O. J. der EU Kommission vom 8. Juni 2000, L136, 85-97.

EU Kommission (2001). Weissbuch für eine neue Chemikalienpolitik. Brüssel, Belgien im Internet:
http://europa.eu.int/comm/environment/chemicals/0188_de.pdf

EU Kommission (2003) EU Richtlinie 2003/15/EG zur Änderung der Richtlinie 76/768/EWG des rates zur Angleichung des rechtsvorschriften der Mitgliedsstaaten über kosmetische Mittel. O. J. der EU Kommission vom 11. März 2003, L66, 26-35

OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) (1982) OECD Guidelines for Testing of Chemicals. Paris, Frankreich: OECD Publikation Office.

OECD (1996) Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Tests Methods. Paris, Frankreich: OECD Publication Office.

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OECD (2002c) OECD guidelines for the testing of chemicals: Test Guideline 428 "Skin absorption: in vitro method ". Paris, Frankreich, OECD Publication Office.

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Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pechovitch G., de Silva, O., Holzhütter, H.G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, G.F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J.M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W. und Brantom, P.:  The international EU/COLIPA in vitro phototoxicity validation study: results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU Phototoxicity test. Toxic. in Vitro 12, 305-327, 1998a

Spielmann, H., Balls, M. Dupuis, J., Pape, W.J.W., de Silva, O., Holzhütter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Pfannenbecker, U. und Brantom, P.: A special study on the phototoxic potential of UV filter chemicals from Annex II of the REU Directive 76/86 in the 3T3 NRU in vitro phototoxicity test. ATLA 26, 979-708, 1998b

Weil, C.S. und Scala, R.A.: Study of intra- and interlaboratory variability in the results of rabbit eye and skin irrtiation tests. Toxicol. Appl. Pharmacol. 19, 276-360; 1971