Ausgabe März 2001

Stufenförmige Testhierarchie

Zu diesen epochalen Errungenschaften zählen sicherlich Hautmodelle, und hier vor allem sogenannte "in-vitro"-Ganzhautmodelle. Ganzhautmodelle sind künstlich im Labor gezüchtete Hautstückchen, die analog zur menschlichen Haut aufgebaut sind und sich daher hervorragend für kosmetische Forschungszwecke eignen. Am prominenten Beispiel der Hautalterung soll gezeigt werden, wie Hautmodelle sinnvoll in eine Testhierarchie für kosmetische Wirkstoffe und Fertigprodukte eingebaut werden können.

Diese Testhierarchie durchläuft dabei drei Stufen. Am Anfang steht das sogenannte Substanz-Screening mit schnell durchzuführenden Tests an einfachen Hautzellkulturen. In diesem Testraster werden aus einer Vielzahl potentieller Wirkstoffe die mit zu geringer Wirksamkeit ausgesondert. In Stufe zwei der Testhierarchie kommen die neuen in-vitro-Hautmodelle zum Einsatz, um unter realistischen Anwendungsbedingungen die kosmetische Wirksamkeit zu untersuchen. In der dritten Stufe erfolgt schließlich die dermatologische Prüfung im Verbraucherpanel.

Chronologische und
umweltbedingte Hautalterung

Abbildung 1a: Mkroskopischer Schnitt durch die Haut einer 21-Jährigen

Abbildung 1b: Mikroskopischer Schnitt durch die Haut einer 66-Jährigen

Abbildung 1
Mikroskopische Schnitte durch die Haut von einer 21-Jährigen (a) und einer 66-Jährigen (b)

In junger Haut ist der untere Teil der Haut, die Dermis sehr regelmäßig aufgebaut. Diese klare Struktur ist im Alter gestört: Die Dermis enthält unregelmäßige Strukturen und Fehlstellen und erscheint weniger kompakt. Die nächsthöhere Schicht, die Epidermis, ist im Alter etwas dünner als in junger Haut. Viel auffälliger als diese geringe Änderung der Epidermisdicke ist aber das Verschwinden der Krümmungen der epidermalen-dermalen Grenzfläche. In gealterter Haut ist diese Grenzfläche flach, was zu einer Schwächung der Kohäsion zwischen Dermis und Epidermis führt. In der obersten Schicht schließlich, dem Stratum Corneum, sind im Mikroskop kaum Unterschiede festzustellen.

Wesentliche Veränderungen betreffen also die tieferen Hautschichten und hier vor allem die Dermis. Die biologische Ursache ist unter anderem in dem stark veränderten Collagenstoffwechsel zu finden. Die Collagene sind mengenmäßig mit ca. 60% der Trockenmasse der Hauptbestandteil der Haut (1). Untersucht man als Maß für die Syntheseaktivität die m-RNA der Fibroblasten einer jungen Alterskohorte mit der einer alten, so stellt man für zum Beispiel Procollagen Typ I eine Abnahme der Syntheseaktivität von ca. 60 % fest (2). Darüberhinaus steigt die Syntheserate für Collagenasen an (2). Es wird im Alter also nicht nur weniger Collagen hergestellt, sondern dieses wenige Collagen auch stärker abgebaut. Und beide Effekte führen zusammen dazu, dass der Collagengehalt im Schnitt um 1 % pro Lebensjahr abnimmt (3).

Wirkstoff-Screening mit
Fibroblasten-Kulturen

Aus einer Reihe verschiedener Weizen-, Milch- und Sojapeptide wurde ein besonders vielversprechendes Sojapeptid 2 identifiziert, das eine 20%ige Aktivierung der Proteinsynthese zeigte (4).

Fibroblasten-Kulturen eignen sich nicht nur zum Studium der Collagensynthese sondern auch zur Untersuchung bestimmter Photoalterungsprozesse. Seit längerem ist bekannt, dass vor allem exzessives Sonnenbaden die Haut altern lässt (5,6). UV-Licht, das auf einen Fibroblasten in der Haut trifft, veranlasst diesen, collagenabbauende Enzyme, sogenannte Collagenasen oder Metallomatrixproteasen (MMP's) zu produzieren. Diese schädlichen Enzyme zerschneiden das Collagen, den Hauptbestandteil des Hautbindegewebes, und führen damit zur frühzeitigen Entstehung von Falten (5,6). Die Reduktion der MMP-1-Synthese nach Sonnenexposition der Haut ist daher ein Hauptziel bei der Entwicklung von Anti-aging-Produkten. Ein idealer Anti-age-Wirkstoff inhibiert bereits in geringer Konzentration die Expression der Collagenase MMP-1. Die Produktion der mRNA ist im Verlauf der MMP-1-Synthese der erste und damit wichtigste Schritt. Wirkstoffe, die einen Effekt auf die mRNA-Produktion zeigen, haben somit automatisch auch einen Effekt auf die Proteinmenge und die Enzymaktivität von MMP-1. Die Quantifizierung der MMP-1 Synthese in Sonnenlicht-bestrahlten Hautfibroblasten erfolgte durch die Bestimmung der synthetisierten Menge der MMP-1-mRNA im Northern-Blot (5).

Die Bestrahlung von Fibroblasten mit simuliertem Sonnenlicht (UVA-Dosis von 10 J/cm2) führte erwartungsgemäß zu einer starken Induktion der MMP-1 mRNA-Synthese. Retinyl-Palmitat und Antioxidantien wie z.B. Propyl-Gallat reduzieren die sonnenlichtinduzierte Expression von MMP-1 sehr effektiv um rund 80 % bzw. 50 bis 75 % und wirken so der Lichtalterung der Haut entgegen.

Abbildung 3a: Wirkung von Retinyl-Palmitat

Abbildung 3a: Wirkung von Propyl-Gallat

Abbildung 3: Schutzwirkung von Retinyl-Palmitat (a) und Propyl-Gallat (b) auf die sonnenlichtinduzierte Collagenaseexpression in Fibroblasten

Neue Untersuchungsmöglichkeiten
mit in-vitro-Ganzhautmodellen

Die in-vitro-Hautmodelle eröffnen neue Wege, all dies Unzulänglichkeiten zu vermeiden. Durch sukzessives Züchten einer Dermis aus Fibroblasten und einer Epidermis mit Stratum Corneum aus Keratinocyten entsteht innerhalb von 5 Wochen ein Ganzhautmodell (Abbildung 4), das alle wesentlichen Schichten der Haut enthält (7) (Abbildung 5).

Abbildung 4: Kultivierung des Ganzhautmodells

Nach der Kultivierung lebt das Ganzhautmodell mindestens 4 Wochen nahezu unverändert weiter. In dieser Zeit können Alterungsexperimente wie zum Beispiel UV-Bestrahlung oder Einwirkung von Ozon durchgeführt werden oder aber auch topische Behandlungen zum Schutz oder zur Pflege der Haut. Der große Vorteil ist, dass diese Hautmodelle ein Stratum Corneum wie normale menschliche Haut enthalten. Die Wirkstoffe können daher unter realistischen Bedingungen in einer Creme- oder Gelgrundlage aufgetragen werden. Die Wirkstoffe dringen durch das Stratum Corneum in die Haut ein und entfalten dort ihre Wirksamkeit.

Für das im Fibroblastenexperiment ausgewählte Sojapeptid 2, ein Cytokin aus der Sojapflanze, konnte nach 2-wöchiger topischer Anwendung aus einer 10%-igen Gelformulierung eine Steigerung der Collagensynthese um 37 % gezeigt werden (8). Zusätzlich stimuliert dieses Cytokin auch die Hyaluronsäuresynthese um 3 %, eine kleine aber dennoch signifikante Steigerung (8) (Abb. 6). Abgebautes Collagen und fehlende Hyaluronsäure können so im Innern der gealterten Haut ersetzt werden.

Abbildung 5 a Abbildung 5 b Abbildung 5: Histologischer Vergleich zwischen Ganzhautmodell (a) und normaler menschlicher Haut (b)

Der stimulierende Effekt des Cytokins auf Hautzellen ist auch in-vivo nachweisbar. In einer klinischen Studie benutzten 10 Freiwillige eine Creme mit 2 % des Cytokins im Halbseitenvergleich mit der Plazebocreme im Augenwinkelbereich. Nach 2 Wochen täglicher Behandlung wurden im Rahmen einer kosmetischen Operation Biopsien genommen und biochemisch auf Collagen- und Glucosaminoglucan (GAG)-Gehalt untersucht. Nach zwei Wochen Behandlung mit der Cytokin-haltigen Creme nahm der Collagengehalt in der Haut um 29 % und der GAG-Gehalt um 20 % zu (8). Die in-vitro-Ergebnisse konnten also eindrucksvoll bestätigt werden.

Abbildung 6: Stimulierung der Collagen- und Hyaluronsäuresynthese durch Cytokin im Ganzhautmodell

Faltenreduktion durch Cytokin-Creme

Literatur

2. J. Varani, J. R. L. Warner, M. Gharaee-Kermani, S. H. Phan, S. Kang, J. Chung, Z. Wang, S. C. Datta, G. J. Fisher, J. J. Voorhees, Vitamin A antagonizes decreased cell growth and elevated collagen-degrading matrix metalloproteinases and stimulates colllagen accumulation in naturally aged human skin, J. Invest. Dermatol. 114 (2000) 480-486

3. S. Shuster, M. M. Black, E. McVitie, The influence of age and sex on skin thickness, skin collagen and density, Brit. J. Dermatology 93 (1975), 639-643

4. C. Augustin, V. Frei, E. Perrier, A. Huc, O. Damour, An in vitro selection of new cosmetic active compounds: From screening tests on monolayered fibroblast culture to efficiency study on 3-D dermal equivalent, J. Appl. Cosmetol. 15 (1997), 1-11

5. K. Scharffetter, M. Wlaschek, A. Hogg, K. Bolsen, A. Schothorst, G. Goerz, T. Krieg, G. Plewig, UVA irradiation induces collagenase in human dermal fibroblasts in vitro and in vivo, Arch. Dermatol. Res. 283 (1991), 506-511

6. G. J. Fisher, S. C. Datta, H. S. Talwar, Z. Wang, J. Varani, S. Kang, J. J. Voorhees, Nature 379 (1996) 335-339

7. C. Augustin, C. Collombel, O. Damour, Use of in vitro dermal equivalent and skin equivalent kits for evaluating cutaneous toxicity of cosmetic products, In Vitro Toxicology 10 (1997), 23-31

8. V. Andre-Frei, E. Perrier, C. Augustin, O. Damour, P. Bordat, K. Schumann, T. Förster, M. Waldmann-Laue, A comparison of biological activities of a new soya biopeptide studied in an in vitro skin equivalent model and human volunteers, Int. J. Cosmet. Sci. 21 (1999), 299-311